Taller de "Ciencia para Jóvenes", 12 - 17 de julio, 1999

"¿Quien infectó la planta de chile?"

(Introduccion a la Biologia Molecular)

El viernes, 16 de julio 1999, vas a participar en un experimento de ingenería genética durante tu visita en los laboratorios de CINVESTAV, Unidad Irapuato. El propósito de estas notas es prepararte a esta visita.

El viernes 16 vas a observar una planta de chile que ha sido víctima de un virus llamado PHV. Las enfermedades virales no son broma (¿cuántos de ustedes no tienen en este momento gripe?). En el caso de las plantas, los virus dañan tremendamente los cultivos y causan fuertes pérdidas económicas. Es importante reconocer al virus que causa la enfermedad y buscar métodos de controlar la enfermedad o bien plantas que sean resistentes a ésta. Durante tu visita vas a utilizar una de las metodologías básicas de la biología molecular, que te permitirá confirmar la presencia de virus en una planta que presenta signos de infección viral y determinar exactamente qué tipo de virus la infecta. Primero vas a obtener un poco de DNA de tejido de hoja y lo vas a someter a PCR utilizando oligos específicos para el PHV y después analizarás tu resultado por electroforésis en gel de agarosa.

Está claro, ¿verdad?

Introducción

Todos los seres vivos tienen DNA. El DNA es la molécula que tiene toda la información genética de cada individuo. Si eres hombre o mujer, güero(a) o moreno(a), alto(a) o bajo(a), se lo debes a tu DNA. Hoy en día entendemos bastante bien cómo se sintetiza el DNA y cómo parte de su información se utiliza para la síntesis de proteínas en cada célula. Entender todas estas cosas es el campo de acción de la llamada biología molecular. Una técnica grandiosa, fabulosa y utilísima en biología molecular es la "reacción en cadena de la polimerasa", mejor conocida como PCR (polymerase chain reaction), pero antes de entrar en esto déjame primero explicarte un poco qué es el DNA y qué es la "replicación".

Estructura de la doble cadena de DNA.

En los humanos y en muchos otros organismos superiores, la molécula de DNA consiste de dos cadenas enrolladas una sobre la otra. Cada cadena es un arreglo lineal de unidades repetidas llamadas nucleótidos, compuestos de un azúcar, fosfato y una base nitrogenada (Fig. 1). Hay 4 bases en el DNA: adenina (A), timina (T), citosina (C), y guanina (G). De aquí en adelante sólo hablaremos de A, G, C o T para referirnos a ellas. El orden de las bases es lo que conocemos como la secuencia del DNA y es la clave para almacenar la tremenda cantidad de información que necesita un organismo. Toda la información de DNA en una célula humana se guarda en 3,000,000,000 de pares de bases.

Con 27 letras del alfabeto se pueden hacer ¿Cuántas palabras? ¿Qué tan largas? (Parangaricutirimícuaro=22 letras). Si cuatro letras te parecen poco (A,G,C y T), prueba a arreglarlas en cualquier combinación y en cualquier tamaño, desde 70 ¡hasta 4000!

Reglas para formar la doble cadena de DNA

Para formar la doble cadena del DNA hay unas reglas estrictas:
  1. Las dos cadenas que forman la doble cadena aparecen con una en un sentido y la otra va en el otro sentido. Las cadenas empiezan con un fosfato (P) y terminan con un hidroxilo (OH).
  2. La A de una cadena sólo puede aparearse con la T de otra cadena, y lo mismo para la C, que sólo puede aparearse con la G.
Por ejemplo, segun estas reglas, una cadena
P-AAAACCCCTTTTGGGG-OH
sólo puede formar una cadena doble con una cadena

OH-TTTTGGGGAAAACCCC-P
(esta sería una cadena complementaria a la primera).

Ahora tú deduce la secuencia de la cadena complementaria del siguiente DNA:

P-TTAGCCCCCGGGTTAAA-OH

 

 

(el apareamiento de bases involucra la formación de puentes de hidrógeno, esto es, que la unión de pares de bases complementarios es energéticamente favorable)

Cada vez que una célula se divide, todo su DNA (su genoma) se duplica. Durante la división la doble cadena se va separando y cada cadena dirige la síntesis de una cadena complementaria. Para esto usa nucleótidos A, G, C, y T que tiene libres y a su disposición, que se "adhieren" siguiendo las reglas anteriores. Cada célula recibe entonces un DNA formado por la cadena viejita que sirvió como molde, unida a la nueva que se formó sobre ésta. De este modo se forman cadenas de DNA idénticas a la anterior y se conserva la información genética.

El proceso de replicación no es espontáneo. Requiere de múltiples enzimas. Podemos simplificarlo y hacerlo in vitro con tan sólo DNA polimerasa, primers y nucleótidos.

La DNA polimerasa es una enzima muy particular que requiere de un "primer". La DNA polimerasa tiene poca iniciativa: no inicia la síntesis de DNA si no tiene un pedacito ya comenzado (un adelanto). Este pedacito se llamará en adelante "primer" y marca el lugar desde el cual la DNA polimerasa simplemente seguirá, a toda velocidad y sin parar, añadiendo nucleótidos complementarios a la secuencia de la cadena molde. Sin discutir el porqué de esta actitud de la polimerasa, pasemos a lo del PCR y veremos las implicaciones que esto tiene para la técnica en cuestión.

Figura 1.

En la doble cadena las dos cadenas van en sentido opuesto y con cada base dispuesta en contraposición (formando puentes de hidrógeno) de exactamente su base complementaria: A - T y G - C. La polimerización de una nueva cadena complementaria se hace usando como molde cada una de las cadenas; éstas se abren y la DNA polimerasa las usa como molde para sintetizar la cadenas complementarias. Si la DNA polimerasa no recibe un "adelanto" (primer) no trabaja.

¿Qué es el PCR?

Mediante la técnica de PCR un segmento definido de DNA puede ser copiado repedidamente in vitro. Esto resulta en la amplificación de secuencias que originalmente existían en un muy reducido número.

La clave de este método está en la enzima DNA polimerasa. Esta es una enzima que puede utilizar una cadena de DNA para polimerizar una cadena complementaria a ésta. Sin embargo, esta enzima no puede empezar de cero. Necesita un pequeño segmento de DNA que esté ya unido al DNA que va a copiar, esto es, necesita un primer. Bien, si tengo un fragmento de DNA de doble cadena y dos primers distintos y cada uno complementario a una de las cadenas del DNA molde, puedo hacer que cada uno de los primers sea el iniciador de la replicación de su cadena molde, como se muestra a continuación:

A. Abro la cadena doble del DNA y permito que cada cadena se acople a su primer complementario.

B. Añado polimerasa y oligonucleótidos y dejo se se copie in vitro cada cadena.

Y ahora viene la amplificación:

C. Cada cadena sintetizada servirá a su vez como molde para copiar una nueva cadena, que a su vez servirá para sintetizar otra cadena, que a su vez ...

De aquí el nombre de reacción en cadena.

A medida que procede la amplificación, la secuencia de DNA se duplica en cada ciclo. Después de 30 ciclos, la amplificación teórica lograda será de 1 000 000 000.

¿Cómo se lleva a cabo el PCR?

Lo primero es separar la doble cadena de DNA, y esto se logra rompiendo por calor los puentes de hidrogeno que las mantienen unidas. Las secuencias de 20 a 30 bases que sirven como primers se diseñan (20-30 nucleotidos) en base a la secuencia que ya conocemos en el DNA que deseamos amplificar y se sintetizan in vitro. Uno de los primers será complementario a una de las cadenas, y a una secuencia localizada al principio de lo que queremos amplificar, y el otro oligonucleótido será complementario a la cadena opuesta y estará al final de la región de interés.

Al utilizar calor para abrir la doble cadena de DNA en cada ciclo, es necesario emplear una DNA polimerasa que resista este tratamiento. Para esto se utiliza la enzima Taq polimerasa, aislada precisamente de una bacteria que habita en aguas térmicas, Thermus aquaticus. Así, a 90ºC se abre la cadena, a 50-60ºC se permite que se una el primer complementario, y a 72ºC se permite la polimerización. Además, todos los ciclos se realizan de manera automatica en máquinas llamadas termocicladores. .

En una reacción de PCR, una cantidad mínima de DNA se añade a un tubo pequeño que contiene una solución de sales con DNA polimerasa, los primers apropiados, los 4 oligonucleótidos y el cofactor. La mezcla se lleva a los ciclos de replicación mencionados. Una vez hecha la amplificación, ya sólo queda observar el DNA resultante por electroforesis. Aquellos que no pudieron ni pronunciar "electroforesis", pasen a esa sección.

¿Cómo saber si realmente funcionó la reacción en cadena de la polimerasa?

No podemos ver el DNA a simple vista, pero podemos ver y manipular MUCHAS moléculas de DNA que hemos sintetizado, si las ponemos en un gel y luego los teñimos con un colorante especial para DNA. Si bien la amplificación de DNA por PCR es impresionante, es importante recordar que la amplificación es selectiva; sólo el segmento de DNA flanqueado por los primers se amplificó exponencialmente. El resto de DNA no se amplifica y queda invisible en el gel.

El gel se prepara dentro de un molde con agarosa y queda ni más ni menos que como una gelatina (ver la Fig. 2). Si dejamos algunos huecos en la parte superior del gel (pozos) los podemos llenar con el DNA que queremos observar. Aquí es donde hablamos de ELECTROFORESIS. El gel de agarosa está sumergido en una solución de sales (ésta permite conducir electricidad) dentro de una caja con un electrodo a cada extremo. Aplicamos un voltaje de manera tal que en el extremo del gel en donde está el DNA quede una carga negativa y al otro extremo quede positiva; el DNA, que tiene una carga negativa se moverá a través del gel hacia la carga positiva. Las moléculas más pequeñas podrán sortear más fácilmente los obstáculos del gel (imagínate una esponja) y avanzarán más rápidamente. El resultado final es que las moléculas de DNA se separan por tamaño (los de adelante (moléculas más pequeñas) corren mucho y los de atrás se quedarán (moléculas más grandes), trás, trás…). Este gel ahora se sumerge en una solución de un compuesto fluorescente llamado bromuro de etidio, el cual se intercala al DNA y nos permitirá verlo si utilizamos luz ultravioleta. Podemos ahora fotografiar este gel y utilizar la fotografía para analizar los resultados. Si usamos fragmentos de DNA de tamaño conocido como estándar, podremos estudiar y determinar el tamaño de las moléculas por comparación con el estándar.

Figura 2. Técnica de electroforésis

Uso de PCR para la detección de virus

Existen múltiples aplicaciones para el PCR, pero una de las más importantes, y de la que nos ocuparemos en nuestro experimento es la de detección. El gran poder de amplificación del PCR puede utilizarse para detectar la presencia de material genético patógeno, como en el caso de las infecciones bacterianas o virales. Las pruebas convencionales de detección involucran el cultivo de microorganismos o el uso de anticuerpos, y peueden llevar semanas y ser muy tediosas. El PCR es flexible y fácil de realizar en muestras de distinata naturaleza y ha sido utilizada con gran éxito en la investigación y diagnóstico de infecciones o de enfermedades hereditarias.

Recordando que es un virus…

  1. Parásitos intracelulares obligados
  2. Pequeños- se pueden filtrar con filtros que retienen bacterias
  3. Contienen un sólo tipo de ácido nucleico (DNA o RNA)
  4. Tienen una cubierta proteica y en ocasiones una cubierta lipídica proveniente del hospedero
  5. Se multiplica en las células vivas utilizando la maquinaria biosintética de éstos
El virus PHV es un geminivirus que infecta plantas de chile. Ha sido bien estudiado y conocemos cada una de las bases de su DNA. Con esta información, podemos hacer pedacitos sintéticos de DNA idénticos al del PHV y usarlos como primers para replicar in vitro al DNA viral. Al ser idénticos a PHV, sólo fragmentos de DNA que tengan esta secuencia de bases podrá ser amplificada, lo que significa que tal vez ningún otro DNA del planeta nos de un fragmento de amplificación igual .

Para que lo crean:

La probabilidad de encontrar una secuencia de DNA definida de tan sólo cuatro bases es:

1/4 (primera posición) X 1/4 (segunda posición) X 1/4 (tercera posición) X 1/4 (cuarta posición) (1/4 viene de que son 4 posibles bases AGCT) = 1/256. Encontraremos esta secuencia tal vez cada 256 pares de bases.

Para 12 pares de bases: 1 vez cada 16,777,216 pares de bases

Para 20 pares de bases: 1 vez cada 90,949,000,000,000 pares de bases

Descripción del experimento

En el experimento detectamos el geminivirus PHV por la técnica de PCR. Los geminivirus son virus de DNA que representan un grave problema para el cultivo de tomate, frijol, algodón y chile, entre otros. Como ya se mencionó, el PCR es una técnica poderosa que tiene gran importancia para la detección y caracterización de agentes infecciosos, incluidos los virus de plantas. En este experimento, utilizaremos un extracto crudo de ácidos nucleicos de hojas de chile en un ensayo de PCR para detectar la presencia de geminivirus.

Se utilizarán hojas de plantas de chile infectadas y sanas. Estas se llamarán simplemente A y B. Tu tendrás que identificar a cual corresponde cada una.

Material de laboratorio

Reactivos

La actividad:

1. Obtención de extracto crudo de hoja: 2. El PCR se hará en un volúmen total de 50 µl de la siguiente manera (el tubo A contendrá el extracto de hoja A y el B el extracto de hoja B):

 

Reactivos

Tubo A

Tubo B

Mezcla de PCR (NTPs, buffer y Taq pol, primers)

8.5 µl

8.5 µl

Extracto de hoja (DNA)

0.5 µl

1 µl

agua

16 µl

40.5 µl

3. Una vez hechas las mezclas, se les pondrá dos gotas de aceite mineral para prevenir su evaporación y se mantendrán en hielo. A las 11:15 a más tardar los grupos de Biotecnología y Bioquímica los llevan al termociclador de Juan Pablo Martínez y los de Ingeniería Genética al de Rafael Rivera.

4. Los tubos serán incubados en un termociclador con el siguiente programa: un paso a 94 °C 2 min seguido por 35 ciclos a 94°C 1 min, 50 oC 1 min, 72°C 3 min (un paso final de extension a 72 °C 7 min).

5. Una vez finalizado el ciclo de PCR, verificar la presencia del fragmento de amplificación esperado mediante análisis de electroforesis de 5-10 ml de la mezcla de PCR en un gel de agarosa al 1.0%. Carril 1: marcador de PM (1000 pb), carril 2, tubo A, carril 3, tubo B, carril 4, 5 ul del extracto crudo de la planta. Correr, teñir y fotografiar.

Primers usados para la amplificación de DNA de geminivirus:

Primer name

Locus

Primer Sequence

PAR1c496

CP gene

5'-AATACTGCAGGGCTTYCTRTACATRGG -3'

PAL1v1978

rep gene

5'-GCATCTGCAGGCCCACATYGTCTTYCCNGT-3'

Resultados y Discusion

Examina la fotografía de tu gel. Comencemos por el marcador estándar. ¿Cuantas bandas ves? ¿Cuáles moléculas son mayores, las de "arriba" o las de "abajo"? (ver tabla 1).

¿Puedes explicar los resultados de los experimentos de PCR?

Posibilidad 1. Se detecta una banda sólo en uno de los carriles. ¿Puedes saber si la banda que observas realmente corresponde a la amplificación por PCR ¿Tiene el tamaño esperado? ¿Que querría decir este resultado?

Posibilidad 2 (escribe tu resultado si es diferente al 1 y comenta al respecto)

 

 

 

 

 

En la Tabla 1 se muestra el tamaño de los fragmentos de restricción generados por la enzima StyI de un DNA que será usado como estándar, que es el de un virus llamado lambda.

Tabla 1. Marcador de tamaño molecular: escalera de 1,000 pb

Fragmento No.

Tamaño (kpb*)

Distancia (mm)

Producto(s) de PCR

1

7.13

    

2

6.11

    

3

5

    

4

4

    

5

3

    

6

2

    

7

1.6

    

8

1

    

9

0.51, 0.52

    

* 1 kpb=1000 pares de bases

Calendario de la Visita

10:00 Llegada al CINVESTAV. Ubicación de grupos en los diferentes laboratorios.

10:15 Comienza montaje de PCR según protocolo.

11:15 Comienza reacción de PCR en termociclador

11:30 Relajarse. Convivencia con integrantes del laboratorio asignado para conocer un poco del trabajo que allí realizan. Preparación de mini-gel de agarosa.

12:30 Recorrido por el Centro

1:00 COMIDA

2:30 Correr electroforesis con las muestras de la reacción de PCR, teñir y tomar foto del resultado.

4:00 Reunión en el comedor para discutir resultados. Habrá refrescas y galletas.

LABORATORIOS

  1. Andrés Cruz, Pedro García (6)

  2. Juan Pablo Martínez, Juan Florencio (3)

  3. Alejandro Blanco, Alicia Chagolla (3)

  4. Víctor Olalde (3)

  5. Jorge Ibarra, Laura Aguilar (4)

  6. Plinio Guzmán, Jaime Bravo (3)

  7. Gabriela Olmedo, Jorge Ramírez (4)

  8. Bety Jiménez, Guillermo Corona (4)

  9. José Ruiz , Claudia León (3)

  10. Arturo Guevara, Luisa López (4)

  11. Neftalí Ochoa, Héctor Górdon (3)

ESCRITO POR: Gabriela Olmedo

DIRECCION TECNICA: Trino Ascencio y Raul Díaz

TECNICAS: PCR y electroforésis.

REPARTO: 12 laboratorios e igual número de estudiantes de posgrado y auxiliares de laboratorio.

RECORRIDOS: Beatriz Jiménez, Yuri Peña y Aída Martínez