Taller de "Ciencia para Jóvenes", CIMAT, 21-28
de julio del 2002
Visita al CINVESTAV, Irapuato
26 de Julio 2002
Introducción
Uno de los problemas más comunes que se encuentran los
agricultores a nivel mundial es la infección de las plantas
por distintos patógenos (organizmos daninos): bacterias, hongos o virus; de estos,
los virus son los
más difíciles de tratar, debido a
que no existen agentes antivirales que permitan que sembradíos
enteros sean recuperados una vez que han sido infectados. Un virus que ataca a un vegetal, al
igual que un virus que ataca a un humano, posee
información genética en la que está codificada la
información necesaria para construir copias de si mismo usando
la maquinaria celular del hospedero para fabricar y ensamblar nuevos
virus. El ciclo de vida de un virus vegetal
involucra la inserción de la partícula infecciosa en las
células de la planta hospedero, junto con la información genética del
virus; esta información es susceptible de ser detectada por
distintas herramientas de la biotecnología. Durante la visita
en el centro vas a realizar una práctica usando una de estas técnicas: el PCR.
Para mas información, hay que leer la sección
"Introducción a la Biología
Molecular (Marco teórico...)", sobre todo la
parte de PCR.
Descripción de la Práctica.
Antecedentes(*)
Algunos agricultores del Estado de Guanajuato han decidido comprar
varias toneladas de semillas de sorgo a un vendedor que les garantiza
que esa semilla se encuentra libre de virus. ¿Cómo puede
asegurarlo? Pues bien, tu tienes la misión de ayudar a estos
agricultores a decidir si esta semilla esta libre de virus o no...
Se te
proporcionarán muestras de ADN total de varios lotes de
semillas y mediante la técnica de PCR podrás determinar
si es cierto que estas plantas vienen libres de virus.
(*) Algunos hechos
(todos) de esta práctica son ficticios y fueron
diseñados solo con fines didácticos.
Tus Objetivos
- Realizar, mediante la técnica de PCR, una
amplificación del ADN de sorgo en las muestras.
- Detectar, mediante una electroforesis, la presencia de ADN viral
en las muestras.
Equipo de laboratorio
- Termociclador
- Micropipetas 20 y 200 µl
- Puntas (1-200 µl)
- Transiluminador UV
- Cámara de electroforesis y fuente de poder
- Minigel
Reactivos
- 3 tubos con distintas muestras de ADN total de
semillas de sorgo
- ADN viral
- Agua
- Marcador "estándar" de ADN 1000 pb
- PCR Supermix: deoxinucleótidos, MgCl2, Taq ADN Polimerasa, Buffer KCl, Agua
- Primers u oligos (Mezcla de oligos forward y
reverse)
Procedimiento de la práctica
10:00 - 12:00
- Aprende a usar las micropipetas
- Prepara
la reacción de PCR:
-
Prepara cinco tubos
eppendorf para PCR. En cada uno añade:
- 22.5 µl de PCR Supermix
- 1 µl de oligos (mezcla de forward y reverse)
- Márca los cinco tubos y añade:
- Al tubo 1: 1 µl de muestra 1
- Al tubo 2: 1 µl de muestra 2
- Al tubo 3: 1 µl de muestra 3
- Al tubo 4: 1 µl de ADN viral
- Al tubo 5: 1 µl de agua
- Corre las reacciones en un termociclador con el
siguiente programa:
- 95°C 7:00 minutos
- 30 ciclos de
- 95°C 1:00 minuto
- 55°C 1:00 minuto
- 72°C 1 minuto
- 72°C 5 minutos
- Prepara un gel de agarosa
al 0.8%
14:00 - 15:00
- Retira las reacciones de PCR del termociclador
- Prepara las muestras para cargarlas al gel
añadiendo a cada tubo 7 µl de buffer de carga
- Carga en el gel 10 µl de cada reacción de
amplificación y carga un ADN patrón (10 µl de Lambda EcoRI
HindIII incluido el buffer de carga)
- Corre la electroforesis a 80 voltios (aprox)
- Encárgale a tu instructor que vigile la
electroforesis para que no corra demasiado y pídele que le apague
oportunamente.
17:00 - 17:30
- Retira la electroforesis
- Observa el gel en luz ultravioleta
- Toma una foto del gel
- Analiza los resultados junto con tu instructor
Coordinación de la visita: Yuri
Peña.