Taller de Ciencia para Jóvenes para alumnos de escuelas preparatorias , CIMAT, Guanajuato, 16 - 22 de Julio, 2006

Notas para el curso de Biología

Por Pedro Noguera, CINVESTAV, unidad Irapuato. pnoguera@ira.cinvestav.mx

Contenido:

· Resumen

· Bioluminiscencia

· Actividades en el curso (día por día)

Resumen

Este curso-taller tiene como propósito mostrar de manera teórica y práctica algunos principios básicos de biología molecular e ingeniería genética. Conocerás qué es el DNA y su importancia en la vida de todo organismo en este planeta. Aprenderás técnicas moleculares que han revolucionado la manera de hacer investigación en biología, con las que podrás extraer y manipular DNA de bacterias, construir un organismo transgénico (genéticamente modificado), y conocer que cada organismo tiene una huella genética que los distingue de cualquier otro. Durante este curso visitarás la Unidad de Biotecnología de Plantas del Centro de Investigación y Estudios Avanzados del I.P.N., en el cual realizarás un análisis molecular que te permitirá detectar si una planta es transgénica o no.

Bioluminiscencia

La bioluminiscencia se define como la producción de luz por organismos vivos. Es un fenómeno frecuente en especies marinas y se estima que el 90% de los seres vivos que habitan en la porción media y abisal de los mares (fosa marina donde la luz no llega) son capaces de producir luz. En habitas terrestres la bioluminiscencia no es común, por lo que la luz emitida por el pescado o la carne en descomposición se debe a las bacterias. En algunas especies la bioluminiscencia sirve como referencia sexual, en otras a modo de cebo. También es usado como defensa para confundir a los depredadores, pero en algunas especies la función no es clara.

Por medio de una simbiosis con bacterias, algunos animales marinos tales como los Cnidarios (corales, medusas y anémonas), gusanos, moluscos, equinodermos y peces, producen luz. En diversos lugares del cuerpo los animales disponen de pequeñas vejigas, comúnmente llamadas fotóforos, donde guardan bacterias luminiscentes. Algunas especies producen luz continua cuya intensidad puede ser neutralizada o modulada mediante diversas estructuras especializadas. Normalmente los órganos luminosos están conectados al sistema nervioso, lo que permite al animal controlar la emisión lumínica a voluntad.

Text Box: Entre los animales bioluminiscentes existe una pequeña medusa (Aequorea victoria) que ha ganado interés por presentar una proteína fluorescente que emite luz verde. Las medusas son animales marinos que pertenecen al filo Cnidario y se caracterizan por presentar un órgano urticante. Su cuerpo es casi siempre transparente, tienen forma de campana flotante o sombrilla cuando esta en fase reproductiva, y el 95% de su cuerpo es agua. En 1960 el Dr Osamu Shimomura observó que esta medusa, que mide entre 5 y 10 cm de diámetro, presenta 2 proteínas: una de ellas es fosforescente (ecuorina), produciendo luz azul, y la segunda es fluorescente. La bioluminiscencia verde se produce en pequeños foto-órganos localizados en el anillo de la campana observándose que la localización es género o especie específica. En 1962 fue descubierto que la medusa Aequorea victoria convierte la luminiscencia azul de la fotoproteína ecuorina en fluorescencia verde, mediante un proceso de transferencia de energía sin emisión y reabsorción de radiación. La proteína fluorescente se conoce como proteína verde fluorescente o GFP (por sus siglas en ingles, green fluorescent protein). En 1992 se demostró que su expresión en organismos distintos de la medusa produce fluorescencia sin requerir cofactor alguno. Su principal ventaja consiste en que la fluorescencia se genera espontáneamente en células vivas y con esto se puede observar también la expresión de genes in vivo en un amplio rango de hospederos.

En la actualidad varias empresas han estado creando organismos transgénicos o genéticamente modificados (OGM) con GFP. Como ejemplos está la creación de ratones transgénicos por parte de la empresa Anticancer Inc, con el propósito de implantarles células cancerosas de humanos; gracias a la fluorescencia se puede observar el movimiento de las células cancerosas en el cuerpo de un ratón vivo.

En la mayoría de los insectos, aves y algunas especies de arácnidos, los machos que copulan por segunda ves con una hembra engendran la mayoría de las crias de la hembra. Este fenómeno comenzó a entenderse en el momento que se utilizo la GFP. Lo que observaron es que el esperma de la segunda pareja desplaza al de la primera.

Dentro de los avances en la inserción de la proteína GFP en mamíferos, está la creación de cerdos transgénicos con GFP y YFP en la universidad de Missouri, Columbia; y el conejo ALBA, el cual en la actualidad vive en una galería de arte.

Se ha pensado utilizar GFP en las gónadas de los mosquitos para poder diferenciar fácilmente los machos de las hembras; de esta forma se retiran a los machos, se esterilizan y se regresan al ambiente natural con lo que se espera que las poblaciones disminuyan y se controle la enfermedad de la malaria.

Recientemente científicos taiwaneses dicen haber creado cerdos fluorescentes verdes que resplandecen completamente, con lo cual se espera que se conozca más sobre la célula madre y entender mejor algunas enfermedades humanas. Una de las ventajas de esto es que se puede ver la evolución del material genético sin hacer biopsias o intervenciones mayores al animal.

El uso de GFP está revolucionando la biología celular al permitir obtener datos sobre la localización, dinámica y redes de interacción molecular de numerosas proteínas con una gran resolución espacial y temporal. También sirven para monitorear cambios bioquímicos dentro de las células.

También se utiliza esta proteína (GFP) para producir organismos transgénicos con interés comercial; por ejemplo, el pez cebra modificado genéticamente que brilla en la oscuridad.

Pero más allá del arte-científico la proteína GFP y otros marcadores se han utilizado para monitorear genes con interés y aplicación biotecnológica, como en el mejoramiento de plantas, hongos y bacterias con las técnicas de ingeniería genética con la finalidad de obtener: mejoramiento de cultivos vegetales de importancia agronómica, producción de vacunas y nuevos medicamentos, enzimas de aplicación industrial e inclusive microorganismos y plantas para limpiar y recuperar el medio ambiente.

Actividades en el curso

Los objetivos de las prácticas del curso son:

· Observar la fluorescencia verde en una bacteria de Escherichia Coli transformada con el gen de la GFP.

· Obtener el DNA de esta bacteria.

· Corroborar por PCR la presencia de dicho gen.

· Insertar este gen a otras bacterias.

· Observar como se regula la expresión del gen de la proteína verde fluorescente.

DIA UNO (lunes)

Observar con una lámpara de luz ultravioleta que las colonias proporcionadas poseen fluorescencia verde. Para la obtención del ADN bacteriano se deben inocular 2 ml de caldo de cultivo e incubar el tubo toda la noche a 37ºC.

DIA DOS (martes)

Transfiere el cultivo a tubos eppendorf de 2 ml. Centrifuga a 6000 rpm durante 5 minutos, decanta el sobrenadante, agrega 1 ml de agua destilada y centrifuga nuevamente a 6000 rpm durante 5 minutos, decanta el sobrenadante y resuspende la pastilla celular en el volumen remanente. Añade 300 µl de la solución de lisis (Tris 10mM, EDTA 4mM, NaCl 20mM, SDS 4%, NaOH 0.04M. pH final 12) homogeniza la solución volteando el tubo lentamente unas cinco veces e incuba a temperatura ambiente 3 minutos. Añade 150 µl NaCl 5M, agita por inversión 6 veces e incuba en hielo durante 10 minutos, centrifuga a 13000 rpm durante 8 minutos y recupera el sobrenadante en un tubo eppendorf nuevo de 1.5 ml. Agrega la solución de RNAsa, incuba a 37°C durante 30 minutos y agrega 150 µl de la solución de precipitación de proteínas (Acetato de amonio 7.5M), agita por inversión 6 veces e incuba en hielo 15 minutos. Centrifuga nuevamente a 13000 rpm durante 20 minutos y transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo. Agrega 700 µl de isopropanol, incuba a -20°C toda la noche.

DIA TRES (miércoles)

Centrifuga a 13000 rpm durante 15 minutos las muestras de ADN que dejaste precipitando. Agrega 500 µl de etanol al 70%, agita suavemente, desecha el etanol y deja secar la pastilla de ADN con la boca del tubo sobre papel higiénico durante 5 minutos. Resuspende el ADN en 50 µl de solución de almacenamiento (agua destilada o buffer TE). Para analizar las muestras de ADN la debes separar de acuerdo a tamaños por medio de un gel de electroforesis. Prepara un gel de electroforesis usando agarosa al 1 % y buffer TAE. Para ello mezcla 50 ml de TAE y 500 mg de agarosa, fúndelos en el horno de microondas y forma el gel vaciando la agarosa fundida sobre la base de la cámara de electroforesis evitando que se tire y se formen burbujas. Coloca el peine para formar los pozos antes de vaciar la agarosa. Toma 3 µl de tus muestras de ADN y añádales 3 µl de buffer de carga y córrelas hasta que el colorante llegue hasta ¾ partes del gel. Tiñe el gel y observa el ADN.

DIA CUATRO (jueves)

Para clonar el ADN que contiene el gen de la fluorescencia de debe hacer lo siguiente: Añade entre 1 y 10 µl del ADN que obtuviste a un tubo con células receptoras. A modo de experimento control toma un tubo de células receptoras y añádales solo agua (el mismo volumen que añadiste del ADN) Incuba en hielo 30 minutos, después debes incubar a 42°C 2 minutos y luego en hielo nuevamente durante cinco minutos. Añade al tubo con las células receptoras 1 ml de medio rico. Incuba a 37°C 1 hora. Toma 200 µl del cultivo y siémbralos en una caja petri con medio rico, marcador de selección (Carbenicilina análogo de la ampicilina) y regulador de la expresión (Arabinosa) y otra caja sin regulador. Incuba toda la noche a 37ºC. Para el cultivo control siembra igualmente 200 µl y siémbralos en una caja petri con medio rico con marcador de selección y sin marcador de selección.

DIA CINCO (viernes)

Visita al Cinvestav Campus Guanajuato (Irapuato): En la visita al Cinvestav Campus Guanajuato (Irapuato) se abordará el controvertido tema de los Organismos Genéticamente Modificados (OGM) u organismos transgénicos.

Mediante un ensayo conocido como PCR aprenderás las metodologías que se usan comúnmente para determinar si una planta es transgénica o si es silvestre. También se realizara el ensayo de PCR para amplificar el gen de la proteína verde fluorescente a las muestras de DNA que extrajiste previamente. Esta reacción de PCR será realizada por los instructores del Taller.

DIA SEIS (sábado)

Observación y discusión de los resultados de PCR para amplificar la proteína verde fluorescente, transformación de células de E. coli con la proteína verde fluorescente y regulación de la expresión de este gen.