Por Yuri Jorge Peña, CINVESTAV, Irapuato
Cada molécula de ADN está constituida por dos cadenas formadas por un elevado número de compuestos químicos llamados nucleótidos. Estas cadenas forman una especie de escalera retorcida ("doble hélice"). Cada nucleótido está formado por tres unidades: una molécula de azúcar llamada desoxirribosa, un grupo fosfato y uno de cuatro posibles compuestos nitrogenados llamados bases: adenina (abreviada como A), guanina (G), timina (T) y citosina (C). La molécula de desoxirribosa ocupa el centro del nucleótido y está flanqueada por un grupo fosfato a un lado y una base al otro. El grupo fosfato está a su vez unido a la desoxirribosa del nucleótido adyacente de la cadena. Estas subunidades enlazadas desoxirribosa-fosfato forman los lados de la escalera; las bases están enfrentadas por parejas, mirando hacia el interior, y forman los travesaños.
Debido a la afinidad química entre las bases, los nucleótidos que contienen adenina se acoplan siempre con los que contienen timina, y los que contienen citosina con los que contienen guanina. Así que las dos cadenas del doble hélice son imagenes una de la otra, en donde la imagen de A es T y la imagen de C es G.
En 1953, el bioquímico estadounidense James Watson y el biofísico británico Francis Crick publicaron la primera descripción de la estructura del ADN. Su modelo adquirió tal importancia para comprender la síntesis proteica, la replicación del ADN y las mutaciones, que los científicos obtuvieron en 1962 el Premio Nobel de Medicina por su trabajo.
Un gen es un segmento de la secuencia de nucleótidos del ADN que contiene las instrucciones para la producción de una proteína.
La producción de una proteina comienza con la separación de la molécula de ADN en sus dos cadenas. En un proceso llamado transcripción, una parte de una cadena actúa como plantilla para formar una nueva cadena que se llama ARN mensajero o ARNm. El ARNm sale del núcleo de la célula y se acopla a los ribosomas, unas estructuras celulares especializadas que actúan como centro de producción de proteínas. Los aminoácidos son transportados hasta los ribosomas por otro tipo de ARN llamado de transferencia (ARNt). Se inicia un fenómeno llamado traducción que consiste en el enlace de los aminoácidos en una secuencia determinada por el ARNm para formar una molécula de proteína.
La sustitución de un nucleótido del ADN por otro que contiene una base distinta hace que todas las células o virus descendientes contengan esa misma secuencia de bases alterada. Como resultado de la sustitución, también puede cambiar la secuencia de aminoácidos de la proteína resultante. Esta alteración de una molécula de ADN se llama mutación. Casi todas las mutaciones son resultado de errores durante el proceso de replicación. La exposición de una célula o un virus a ciertas radiaciones o a determinados compuestos químicos aumenta la probabilidad de mutaciones.
La medicina forense utiliza técnicas desarrolladas en el curso de la investigación sobre el ADN para identificar delincuentes. Las muestras de ADN tomadas de semen, piel o sangre en el escenario del crimen se comparan con el ADN del sospechoso; el resultado es una prueba que puede utilizarse ante los tribunales. (Véase la sección "Pruebas moleculares".)
La agricultura y la ganadería se valen ahora de técnicas de manipulación de ADN conocidas como ingeniería genética y biotecnología. Las estirpes de plantas cultivadas a las que se han transferido genes pueden rendir cosechas mayores o ser más resistentes a los insectos. También los animales se han sometido a intervenciones de este tipo para obtener razas con mayor producción de leche o de carne o variedades de cerdo más ricas en carne y con menos grasa.
La idea de Mullis es no solo la duplicación del ADN, sino involucra tambien una estrategia para replicar solo un segmento del ADN que uno desea amplificar. La estrategia se basa en que la ADN polimerasa es una enzima con poca iniciativa: no inicia la síntesis de ADN si no tiene un pedacito de la cadena complementaria ya comenzado. Este pedacito se llamará en adelante "primer" (un adelanto); el "primer" sirve para marcar el lugar desde el cual la ADN polimerasa inciará la producción de la cadena hija, a toda velocidad y sin parar, añadiendo nucleótidos complementarios a la secuencia de la cadena molde. Otra característica crucial del ADN es su capacidad de separarse en dos cadenas cuando se le calienta; cuando se regresa a temperatura más baja las cadenas complementarias hibridan (se aparean) nuevamente .
Ejemplo: tenemos dos segmentos de doble cadena de ADN:
a)
CAGCCGTAATTG
GTCGGCATTAAC
b)
TTGGTGCAATCC
AACCTCGTTAGG
Con calor las separamos:
CAGCCGTAATTG+GTCGGCATTAAC+TTGGTGCAATCC+AACCTCGTTAGG
Cuando retiramos el calor las cadenas hibridan sólo con sus complementarias, asi que recuperamos por ejemplo el primero
CAGCCGTAATTG
GTCGGCATTAAC
pero NO ocurre la combinacion
CAGCCGTAATTG
AACCTCGTTAGG
Basado en estas propiedades, Mullis hizo una síntesis química de pequeños "primers" que flanquean a una secuencia de interés y colocando un exceso de estos en un tubo de ensayo junto con ADN polimerasa, nucleótidos y una muestra de ADN, pudo amplificar una secuencia de 600 bases de una doble cadena de ADN con 70,000,000 bases, lo que equivale en Biología molecular a hallar una aguja en un pajar.
Al utilizar calor para abrir la doble cadena de ADN, es necesario emplear una ADN polimerasa que resista este tratamiento. Para esto se utiliza la enzima Taq polimerasa, aislada precisamente de una bacteria que habita en aguas térmicas (Thermus aquaticus). Así, en cada ciclo del proceso, a 90ºC se abre la doble cadena, a 50-60ºC se permite que se una el "primer", y a 72ºC se permite la creación de cadena nueva. Además, todos los ciclos se realizan de manera automatica en máquinas llamadas termocicladores.
Una vez hecha la amplificación, ya sólo queda observar el ADN resultante por electroforesis (ver mas adelante).
Para que lo crean: La probabilidad de encontrar una secuencia de ADN definida de tan sólo cuatro bases es:
1/4 (primera posición) X 1/4 (segunda posición) X 1/4 (tercera posición) X 1/4 (cuarta posición) (1/4 viene de que son 4 posibles bases AGCT) = 1/256. Encontraremos esta secuencia en una en cada 256 secuencias de 4 pares de bases.
Para 12 pares de bases: una en cada 16,777,216 secuencias de 12 pares de bases...
Para 20 pares de bases: una en cada 90,949,000,000,000 secuencias.
En la figura que se adjunta al final se ilustra una reacción de PCR en sus primeros tres ciclos. Nótese como el número de cadenas hijas va duplicándose a cada ciclo, además las que van predominando son aquellas que tienen un tamaño limitado por los "primers".
No podemos ver el ADN a simple vista, pero podemos ver y manipular MUCHAS moléculas de ADN que hemos sintetizado, si las ponemos en un gel y luego los teñimos con un colorante especial para ADN. Si bien la amplificación de ADN por PCR es impresionante, es importante recordar que la amplificación es selectiva; sólo el segmento de ADN flanqueado por los "primers" se amplificó. El resto de ADN no se amplifica y queda invisible en el gel.
El gel se prepara dentro de un molde con agarosa y queda ni más ni menos que como una gelatina. Si dejamos algunos huecos en la parte superior del gel (pozos) los podemos llenar con el ADN que queremos observar. Aquí es donde hablamos de ELECTROFORESIS. El gel de agarosa está sumergido en una solución de sales (ésta permite conducir electricidad) dentro de una caja con un electrodo a cada extremo. Aplicamos un voltaje de manera tal que en el extremo del gel en donde está el ADN quede una carga negativa y al otro extremo quede positiva; el ADN, que tiene una carga negativa se moverá a través del gel hacia la carga positiva. Las moléculas más pequeñas podrán sortear más fácilmente los obstáculos del gel (imagínate una esponja) y avanzarán más rápidamente. El resultado final es que las moléculas de ADN se separan por tamaño (los de adelante (moléculas más pequeñas) corren mucho y los de atrás se quedarán (moléculas más grandes), trás, trás…). Este gel ahora se sumerge en una solución de un compuesto fluorescente llamado bromuro de etidio, el cual se intercala al ADN y nos permitirá verlo si utilizamos luz ultravioleta. Podemos ahora fotografiar este gel y utilizar la fotografía para analizar los resultados. Si usamos fragmentos de ADN de tamaño conocido como estándar, podremos estudiar y determinar el tamaño de las moléculas por comparación con el estándar.
Diagrama de la técnica de electroforésis